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R&D Systems試劑Q&A常見問題解答

更新時(shí)間:2010-08-03      瀏覽次數(shù):3875

                                 R&D Systems試劑 Q&A 常見問題解答

 

問:R&D Systems有分裝試劑嗎?
答:沒有分裝試劑。R&D Systems公司不會(huì)分裝,也沒有授權(quán)任何公司進(jìn)行分裝。目前市場上所謂的“RD分裝試劑”是沒有*的3無產(chǎn)品,R&D Systems公司不承擔(dān)任何“RD分裝試劑”的售后服務(wù)。在此,建議廣大客戶和經(jīng)銷商從R&D Systems中文上公布的正規(guī)經(jīng)銷商處訂購。
 
 
抗體
問:目錄中抗體的名稱有AB, AF, BAF, MAB之分,它們有何不同?
答:帶有AB的抗體是用G蛋白純化的,帶有IgG成分;帶有AF的抗體經(jīng)G蛋白純化后又經(jīng)抗原親和層析純化。所以,AF抗體為抗原特異性的IgG,而AB抗體含有與目標(biāo)分析物非特異性的IgG。BAF是生物素化的AF抗體;MAB是單克隆抗體。
問:IgG的分子量是多少?
答:IgG的分子量是150kDa。它由兩條50kDa的重鏈和兩條25kDa的輕鏈組成。
問:某一單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位是什么?
答:R&D Systems不做抗原表位的定位。抗體是針對(duì)整個(gè)免疫原(列在數(shù)據(jù)表中)的。
問:某一多克隆抗體所識(shí)別的抗原表位是什么?
答:多克隆抗體有多個(gè)抗原表位識(shí)別位點(diǎn)??贵w是針對(duì)整個(gè)免疫原(列在數(shù)據(jù)表中)的。
問:什么是Thehalose?它為什么在這個(gè)抗體上?
答:Thehalose是一種非還原糖(分子量為342.1), 它在梅拉德式(Maillard)反應(yīng)中與氨基酸和蛋白都不作用。它存在于許多植物和動(dòng)物中。有報(bào)道稱Thehalose是穩(wěn)定蛋白抗御冰凍的zui有效抗凍劑,它使得蛋白抵御水分的能力增加從而使產(chǎn)品在重新溶解時(shí)不容易產(chǎn)生沉淀物。
問:采用Trehalose穩(wěn)定蛋白的原因是什么?
答:Trehalose主要用于在冰凍和脫水過程中保護(hù)蛋白。它是非還原糖,在干粉化時(shí)呈非結(jié)晶狀。
 
 
 
細(xì)胞凋亡
 
問:為什么有兩套不同的TUNEL試劑盒?
答:因?yàn)橛袃煞N不同的TUNEL方法可檢測細(xì)胞凋亡。*種方法采用TdT酶(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)將生物素化的核苷酸加到組織中的DNA片段的3'-羥基端。加入正離子可使這種標(biāo)記更有效,經(jīng)生物素化的核苷酸可用streptavidin-HRP共軛物和底物來檢測。
第二種方法仍采用TdT酶(末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)將核苷酸加到樣本中的DNA片段的3'-羥基端,但采用5-溴脫氧尿苷(BrdU)標(biāo)記而非生物素,再用生物素化的抗5-溴脫氧尿苷(BrdU)抗體來檢測。采用這種方法的細(xì)胞凋亡檢測試劑盒包括:TA100 TACS-XL基本原位細(xì)胞凋亡試劑盒;TA200 TACS-XL DAB原位細(xì)胞凋亡試劑盒;TA300 TACS-XL藍(lán)色標(biāo)記原位細(xì)胞凋亡試劑盒;TA400 TACS-XL補(bǔ)充細(xì)胞凋亡試劑盒;
問:Caspase活性測試是如何使用的?
答:Caspase活性測試為在細(xì)胞裂解液中檢測蛋白酶活性提供了簡捷方便的手段。當(dāng)對(duì)專一Caspase的多肽底物被裂解時(shí),釋放出的指示分子可用普通讀光儀或熒光讀板儀來做定量測定。將從細(xì)胞凋亡樣本得到的信號(hào)同未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照樣本進(jìn)行比較,可以確定Caspase活性增加的倍數(shù),而Caspase酶活性是同檢測到的信號(hào)直接成正比。
問:Caspase活性測試是否可用于定量檢測?
答:R&D Systems的Caspase活性測定試劑盒可作為半定量測試。檢測結(jié)果用于測量在細(xì)胞凋亡細(xì)胞中與未經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞中的Caspase活性倍數(shù)的增加。實(shí)驗(yàn)時(shí),采用本底對(duì)照(無細(xì)胞裂解液或無底物的反應(yīng))。如果本底對(duì)照也有一定的讀數(shù),這一讀數(shù)應(yīng)當(dāng)在記算倍數(shù)增加之前從試驗(yàn)數(shù)據(jù)中差減。
問:Caspase活性檢測同Caspase ELISA試劑盒有何不同?
答:Caspase活性檢測用于測定不同Caspase的蛋白酶的活性,表達(dá)為比未誘導(dǎo)樣本的倍數(shù)增加。Caspase ELISA試劑盒用于測定不同Caspase在樣本中的含量,以pg /mL定量表達(dá)。
問:caspase X 活性測試是對(duì)caspase X專一的嗎?
答:大多數(shù)caspase會(huì)裂解所有的底物,它們根據(jù)Michaelis-Menton動(dòng)力學(xué)趨于選擇某一底物而非另一底物,但沒有任何底物是對(duì)某一Caspase專一的。比如,Caspase 3和Caspase 7都可裂解DEVD底物;Caspase 9、4、5 都可裂解LEHD。R&D Systems為每一Caspase選擇了它所適宜的底物。 如果反應(yīng)進(jìn)行的太久,一些Caspase會(huì)激活另一些Caspase。
問:Caspase活性檢測試劑盒中的細(xì)胞裂解液是否同其它試劑盒中的一樣?
答:所有的Caspase活性檢測試劑盒中的細(xì)胞裂解液都是一樣的。所以,可用它裂解細(xì)胞,和用于多種Caspase活性的測試。
問:R&D SystemsCaspase抑制劑是否可逆?
答:所有R&D Systems的Caspase抑制劑在N端有苯甲氧碳基(Z-)和FMK功能組,它們可穿孔細(xì)胞,是不可逆轉(zhuǎn)的。
問:R&D Systems是否為Caspase活性檢測提供陽性對(duì)照?
答:R&D Systems提供多種重組Caspase酶,它們是理想的陽性對(duì)照。如果試驗(yàn)者自己想建立一陽性對(duì)照,有許多可以產(chǎn)生細(xì)胞凋亡的陽性對(duì)照的方法都已發(fā)表。如果將細(xì)胞同2 mM星形孢菌素(Staurosporin)溫育2小時(shí),可誘導(dǎo)絕大多數(shù)細(xì)胞類型進(jìn)入細(xì)胞凋亡。R&D Systems有文獻(xiàn)資料列舉了對(duì)Caspase如何產(chǎn)生陽性對(duì)照,可向我們的技術(shù)服務(wù)索取。
 
 
 
ELISA
酶聯(lián)吸附免疫法
 
問:人的Quantikine ELISA試劑盒是否有相關(guān)的對(duì)照?
答:R&D Systems為人的Quantikine ELISA試劑盒提供三重對(duì)照組。請同我們以便確定產(chǎn)品的目錄號(hào)。
問:我想使用你們目錄中的重組蛋白作為我的ELISA的對(duì)照,但我發(fā)現(xiàn)質(zhì)量上有差異。這是為什么?
答:首先要考慮的是重組蛋白的質(zhì)量會(huì)高出試劑盒的可測試范圍數(shù)倍,必須將重組蛋白稀釋多次才能得到試劑盒的測試范圍。一般來說是從mg/毫升稀釋到pg/毫升,在這中間光是移液管的誤差就達(dá)到了可測量的水平。
其次要考慮的是R&D Systems的免疫測試方法測量的蛋白水平是用一種抗體捕獲的、用第二種抗體測定的,這種測定是在試劑盒研發(fā)時(shí)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白校正過的。這些經(jīng)過測定的早期標(biāo)準(zhǔn)蛋白成為基本校正物,后來的標(biāo)準(zhǔn)都同它校正。這樣不同生產(chǎn)批號(hào)的免疫測定試劑盒將是一致的。這些基本校正物蛋白質(zhì)量的測量方法也許與你的試劑管中蛋白質(zhì)量的測定方法有所不同。
問:什么是競爭性ELISA?
答:競爭ELISA基于競爭結(jié)合技術(shù),即樣本中的待測分子與固定量的標(biāo)記的同樣分子(我們一般用堿性磷酸酶作為標(biāo)記)同時(shí)與固定在孔板上的抗體的同一結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行競爭,參照標(biāo)準(zhǔn)曲線,試驗(yàn)數(shù)據(jù)值是定量的。
問:什么是夾心ELISA?
答:夾層ELISA采用對(duì)樣本中分析物的特異的抗體作為固定化的捕獲抗體,然后用第二個(gè)帶標(biāo)記的抗體作檢測,檢測抗體對(duì)分析物也是專一的。當(dāng)參照標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí),試驗(yàn)數(shù)據(jù)值是定量的。
問:什么是直接ELISA
答:直接ELISA是將被測的分析物直接包膜在微孔板表面,然后用測試抗體來證實(shí)被測分析物的存在。當(dāng)與重組蛋白(標(biāo)準(zhǔn)曲線)進(jìn)行參照時(shí),試驗(yàn)數(shù)據(jù)值是半定量的。
問:R&D Systems Parameter品牌的ELISA試劑盒可以做多少個(gè)樣本?
答:R&D Systems Parameter品牌的ELISA試劑盒可以做6點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、對(duì)照和41個(gè)樣本(每個(gè)樣本做雙份)。
問:R&D SystemsQuantikine品牌人的ELISA試劑盒可以做多少個(gè)樣本?
答:大多數(shù)R&D Systems 的Quantikine品牌人的ELISA試劑盒可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線、對(duì)照和40個(gè)樣本(每個(gè)樣本做雙份)。
問:R&D SystemsQuantikine品牌的小鼠、大鼠和豬的ELISA試劑盒可以做多少個(gè)樣本?
答:Quantikine品牌的小鼠或大鼠的ELISA試劑盒中的每一微孔板可以做標(biāo)準(zhǔn)曲線、對(duì)照和39個(gè)樣本(每個(gè)樣本做雙份)。Quantikine品牌的小鼠或大鼠的ELISA試劑盒中,有些有兩個(gè)微孔板,有些只有一個(gè)微孔板。
問:R&D Systems建議用什么樣的ELISA微孔板來做DuoSets和抗體配對(duì)實(shí)驗(yàn)?
答:在R&D Systems本部,我們用Costar的微孔板(目錄#2592)。Costar的是(800)492-1110。
問:R&D Systems用什么純度的BSAELISA?
答:為了ELISA,我們采用Serological Proteins的BSA(目錄#82-045)。Serological Proteins的是(815)937-8270。
問:Quantikine ELISA試劑盒里都包括什么?
答:R&D Systems的Quantikine ELISA試劑盒是一個(gè)完整的試劑盒。它包含了一個(gè)已包板的微孔板、酶標(biāo)抗體、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、稀釋劑、底物、終止劑、洗液和微孔板密封膜。所有試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)說明書中所列樣本都經(jīng)充分驗(yàn)證,確保高質(zhì)量。
問:什么是DuoSet?
答:DuoSet ELISA開發(fā)系統(tǒng)提供了足夠的捕獲抗體、測試抗體、標(biāo)準(zhǔn)蛋白和Streptavidin-HRP,可以做大約十五個(gè)96孔微孔板的實(shí)驗(yàn)。我們還提供了樣本試驗(yàn)流程和與這一系統(tǒng)配套的試劑。DuoSet ELISA開發(fā)系統(tǒng)主要是為高通量篩選細(xì)胞培養(yǎng)的上清液所設(shè)計(jì),但熟悉ELISA研發(fā)的實(shí)驗(yàn)人員已成功將其推廣到血清和血漿樣本的使用。
問:什么是R&D Systems的抗體配對(duì)?
答:R&D Systems的抗體配對(duì)是一個(gè)自己動(dòng)手的產(chǎn)品。R&D Systems建議此產(chǎn)品的使用者在免疫測試的開發(fā)方面應(yīng)很有造詣。使用者必須以經(jīng)驗(yàn)為依據(jù)來決定捕獲抗體和測試抗體的*濃度。R&D Systems的重組細(xì)胞因子并未經(jīng)ELISA校正,所以在使用前必須經(jīng)ELISA做質(zhì)量校正。更多有關(guān)ELISA開發(fā)的信息可參照我們的《ELISA開發(fā)指導(dǎo)》 (: http://www.rndsystems.com/tsg_detail_objectname_elisa_development.aspx) 。
問:QuantikineQuantiGlo ELISA試劑盒有何不同?
答:R&D Systems的Quantikine牌子的ELISA試劑盒是一種比色法檢測,需要一臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)讀光儀配備有合適的濾光片可用于讀數(shù)和光波長校正。QuantiGlo ELISA試劑盒采用了一種熒光底物,計(jì)數(shù)為光流明或相對(duì)光單位(RLU)。因此,QuantiGlo ELISA試劑盒需要有熒光讀光儀。這種熒光讀光儀需設(shè)置在:1.0分鐘的滯待時(shí)間;1.0秒/孔的讀數(shù)時(shí)間;累計(jì)狀態(tài);自動(dòng)獲取開啟。R&D Systems使用Dynex Technologies的熒光讀光儀。
問:普通Quantikine ELISA試劑盒同高靈敏Quantikine ELISA試劑盒有何不同?
答:高靈敏Quantikine ELISA試劑盒一般用于非常低量的細(xì)胞因子的檢測,比如正常人(健康狀態(tài)時(shí))的血清和血漿。當(dāng)普通Quantikine試劑盒一般檢測不到(或幾乎檢測不到)正常人血清和血漿中的細(xì)胞因子,可選擇高靈敏Quantikine。我們建議實(shí)驗(yàn)者先查閱文獻(xiàn)資料來確定試驗(yàn)的測試范圍以選擇所需的試劑盒的種類。
問:R&D SystemsQuantikine試劑盒是否可用于組織勻漿(或其它未經(jīng)檢驗(yàn)的)樣本?
答:很遺憾,R&D Systems尚未采用組織勻漿作為樣本對(duì)Quantikine系列的試劑盒做效果驗(yàn)證。如果要決定試劑盒是否可用于未經(jīng)檢定的樣本,實(shí)驗(yàn)者先做一個(gè)“摻入和回收預(yù)試驗(yàn)”。簡單來說,實(shí)驗(yàn)者將樣本分為兩份:一份中摻入一定量的試劑標(biāo)準(zhǔn),然后做一稀釋系列(一般稀釋到1:16),再將摻入過的一份同未摻入的一份相比。采用以下的公式來計(jì)算回收率(%):測試值(pg /毫升)/ 期待值(pg /毫升)x 100% = % 回收率。一般來說,回收率在80-120%可認(rèn)為是可接受的。但是,可接受范圍應(yīng)由每一實(shí)驗(yàn)室自行決定。這種方法可用于檢定未被R&D Systems檢定的任何樣本。我們還有更加詳細(xì)的“摻入和回收”的實(shí)驗(yàn)步驟,可向我們的技術(shù)服務(wù)部索取。我們也可進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)看一看是否有其他試驗(yàn)人員用我們的產(chǎn)品做過不同的樣本,或不同的屬種。
問:加入稀釋劑是否會(huì)將樣本進(jìn)一步稀釋?
答:因?yàn)橄♂寗┦羌尤氲剿械目字校瑯?biāo)準(zhǔn)和被測樣本都被同樣稀釋,所以樣本的濃度可從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出,而不需作稀釋調(diào)整。
問:我是否可將標(biāo)準(zhǔn)曲線的兩端延伸?
答:在任何情況下,我們都不支持超出確定范圍的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在我們確定的測試范圍,我們保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性。
問:為什么不將測試范圍延伸到所述的靈敏度?
答:靈敏度是統(tǒng)計(jì)中大于零的可測到的zui低值。它是通過本底信號(hào)和試驗(yàn)的可變性計(jì)算出來的。靈敏度是將20個(gè)零復(fù)制物的中值加兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差從標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成分析物的濃度。而zui低標(biāo)準(zhǔn)是我們可以放心的、仍可與標(biāo)準(zhǔn)曲線成直線相關(guān)的zui低點(diǎn),因而是可定量的。
問:Quantikine試劑盒中的試劑是否可互換?
答:如果試劑盒(RD1-, RD5-, RD6-)中的稀釋劑有相同的組件號(hào)和批量號(hào),它們可以互換。R&D Systems做“整個(gè)試劑盒的質(zhì)量控制”,就是說,我們不支持不同批號(hào)之間的替代。在任何情況下,微孔板和共軛物都不可互換。
問:Quantikine試劑盒中的洗液是否可互換?
答:如果組件號(hào)相同,洗液在相同類型的試劑盒之間(普通試劑盒之間,或高靈敏度試劑盒之間)是可以互換的。但是,普通Quantikine試劑盒中的洗液不能用于高靈敏度的試劑盒,在普通Quantikine試劑盒中的洗液含有磷酸,會(huì)干擾高靈敏度Quantikine試劑盒中由NADPH驅(qū)動(dòng)的信號(hào)擴(kuò)增。
問:在某些實(shí)驗(yàn)中為什么必須使用聚丙烯(polypropylene)的試管做標(biāo)準(zhǔn)稀釋?
答:有些細(xì)胞分子會(huì)粘到玻璃或聚苯乙烯(polystyrene),但不粘聚丙烯。
問:在Quantkine試劑盒中沒有足夠的RD5校正物來稀釋我的細(xì)胞上清液,我該怎么辦?
答:你可用細(xì)胞培養(yǎng)液來做起始的稀釋,直接移液到微孔板的zui終的1:10稀釋可使用校正物來稀釋。
問:我的Quantikine試劑盒中的RD1測試稀釋劑看上去有沉淀物,可以用嗎?
答:有些RD1測試稀釋劑的確有不同程度的沉淀物。在這種情況下,我們在實(shí)驗(yàn)步驟手冊中已做紀(jì)錄。
問:標(biāo)準(zhǔn)曲線為什么要采用4-pl擬合?
答:R&D Systems在研發(fā)和質(zhì)控我們絕大多數(shù)的Quantikine ELISA試劑盒時(shí),采用4-相參數(shù)的曲線擬合(又名為4-pl或sigmoidal曲線擬合)。一般來說,它比log-log和直線有更好的曲線擬合。如果數(shù)據(jù)分析不可用4-pl的話,log-log是下一個(gè)的選擇。
問:試驗(yàn)步驟中說要用500 rpm,我的搖床達(dá)不到。這個(gè)速度是正確的嗎?
答:500 rpm使用的是0.12英寸的震蕩軌道。如果你的震蕩器用更大的震蕩軌道,500 rpm的確是過快了。在這種情況下,你應(yīng)根據(jù)R&D Systems的建議重新調(diào)整震蕩速度。你可拿一個(gè)多余的96孔微孔板,加入洗液,洗液的量與實(shí)驗(yàn)時(shí)孔中的溶液量一致;封板后,調(diào)整震蕩器的速度,直到液體在孔的上部劇烈旋轉(zhuǎn)但不濺到封膜上或產(chǎn)生泡沫為止。
問:我有太大變異系數(shù)(CV)的問題,是怎么回事?
答:zui大但不是*的兩個(gè)原因,可能是移液誤差和清洗方式。你可參照我們的《如何成功地操作ELISA指導(dǎo)》,:http://www.rndsystems.com/tsg_detail_objectname_elisa.aspx
問:Quantikine ELISA試劑為什么需要做稀釋?
答:主要有兩個(gè)原因:一,在絕大多數(shù)的樣本中細(xì)胞因子的含量非常高,如不經(jīng)稀釋,讀數(shù)將高于標(biāo)準(zhǔn)曲線;二,也是zui普遍的原因我們建議做稀釋,是將樣本中的干擾或基質(zhì)效應(yīng)稀釋掉。 
問:我是否可以在任何過夜步驟停止Quantikine試驗(yàn)、延長溫育時(shí)間、或提高溫育的溫度?
答:R&D System不建議對(duì)任何Quantikine ELISA延長溫育時(shí)間。而且,當(dāng)實(shí)驗(yàn)步驟改變了,我們無法保證Quantikine ELISA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。R&D System做“整個(gè)試劑盒的質(zhì)量控制”,就是說我們無法支持改變過的實(shí)驗(yàn)步驟,因?yàn)樗鼈兾唇?jīng)質(zhì)量控制。延長溫育時(shí)間、或提高溫育溫度以縮短溫育時(shí)間會(huì)提高實(shí)驗(yàn)的本底(又名空白或零標(biāo)準(zhǔn))。這樣一來,樣本和標(biāo)準(zhǔn)中的低量細(xì)胞因子會(huì)測不到,因?yàn)樵龈吡说谋镜仔盘?hào)將從所有孔中的數(shù)值中差減。
問:我用了DuoSet ELISA開發(fā)系統(tǒng),但幾乎就沒有顏色產(chǎn)生。那些步驟可能出了問題?
答:很多方面都會(huì)影響到顏色的產(chǎn)生。比如:
1)    BSA的干擾。選擇不含脂肪酸的ELIS*別的BSA很重要,可以降低球蛋白對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。R&D Systems建議使用Serological Proteins的BSA(目錄#82-045)。
2)    非室溫下的試劑在使用時(shí)會(huì)抑制信號(hào);如果室溫過低,信號(hào)也會(huì)被抑制。
3)    如果使用了未表明為“高結(jié)合性ELISA”的微孔板,捕獲抗體同微孔板的結(jié)合就不牢固,從而導(dǎo)致測試的顏色產(chǎn)生過低。
4)    任何試劑,如果配制出錯(cuò)、儲(chǔ)藏不當(dāng)、或已過期,都將出現(xiàn)這一問題。
5)    讀板時(shí)使用的波長同低物的波長不一致。
問:我是否可以使用你們的抗體配對(duì)ELISA中的抗體,但用另一家公司的蛋白為標(biāo)準(zhǔn)?
答:若使用一家公司的抗體而用另一家公司的標(biāo)準(zhǔn)的帶來問題是它們會(huì)有不同的免疫活性(或不同的抗體與重組蛋白的結(jié)合力)。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)是因?yàn)樽鳛闃?biāo)準(zhǔn)的重組蛋白同作為抗體免疫原的重組蛋白在蛋白序列或折疊中會(huì)有所不同,如果蛋白序列或折疊的不同發(fā)生在抗體結(jié)合部位,就會(huì)引起抗體對(duì)重組蛋白標(biāo)準(zhǔn)的不識(shí)別或識(shí)別很差。
 
 
 
ELISpot
酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)
 
問:什么是ELISpot?
答:R&D Systems的ELISpot測試采用了ELISA技術(shù)。先將對(duì)某一細(xì)胞因子專一的單克隆抗體固定于微孔板的PVDF膜上,再將經(jīng)適當(dāng)刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞移液到微孔中,然后將整個(gè)微孔板放置在保濕的370CCO2培養(yǎng)箱中溫育特定的時(shí)間;在溫育的這段時(shí)間里,固定化的抗體與它們周圍分泌細(xì)胞析出的細(xì)胞分子結(jié)合;洗掉細(xì)胞和未結(jié)合的分子,加入對(duì)這一細(xì)胞因子有特異性的生物素化的多克隆抗體;清除未結(jié)合生物素化的抗體,加入經(jīng)streptavidin共軛的堿性磷酸酶;將未結(jié)合的酶從反應(yīng)中洗除后,再加入底物溶液(BCIP/NBT);一個(gè)藍(lán)黑色的沉淀(斑點(diǎn))在細(xì)胞因子產(chǎn)生的位置形成,每一斑點(diǎn)代表了分泌特定細(xì)胞因子的細(xì)胞。這些斑點(diǎn)可用自動(dòng)讀板系統(tǒng)(不同于普通讀光儀)讀出;或者,這些斑點(diǎn)也可用立體顯微鏡手控讀出。
問:ELISpotELISA有何不同?
答:ELISA實(shí)驗(yàn)測量的是樣本中某一細(xì)胞因子的總量(一般表示為pg或ng /mL);ELISpot實(shí)驗(yàn)并不測定樣本中某一細(xì)胞因子的量,而是測定有多少細(xì)胞在分泌某一細(xì)胞因子。
問:ELISpot與組件有何不同?
答:R&D Systems的ELISpot試劑盒含有:對(duì)某一細(xì)胞因子有特異性的單克隆抗體(這一抗體已預(yù)先固定在微孔板的PVDF膜上)、生物素化的檢測抗體,Streptavidin共軛的堿性磷酸酶、BCIP/NBT產(chǎn)色物、和重組細(xì)胞因子陽性對(duì)照。試劑盒備有試驗(yàn)所需所有的用品,試驗(yàn)者不需再進(jìn)行優(yōu)化。
     
R&D Systems的ELISpot開發(fā)試劑分為兩個(gè)必需組分,必須分別購買對(duì)細(xì)胞因子具有特異性的開發(fā)組件和ELISpot藍(lán)色組件。對(duì)細(xì)胞因子專一的開發(fā)組件包括對(duì)細(xì)胞因子特異的捕獲抗體和檢測抗體;ELISpot藍(lán)色組件(目錄#SE002)對(duì)所有R&D Systems的對(duì)細(xì)胞因子特異的開發(fā)組件都適用,它包含Streptavidin-堿性磷酸酶和BCIP/NBT產(chǎn)色物。
問:我是否可只使用ELISpot試劑盒中的部分微孔板?
答:因?yàn)閹в蠵VDF膜的微孔板很靈敏,我們不能將微孔板做成條狀的形式。如溫育多次,我們將不能保證使用微孔板所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果;因?yàn)槲⒖装宀辉贌o菌,所以未使用的微孔可能有污染。我們并不擔(dān)心*次使用時(shí)污染會(huì)有,因?yàn)榇蠖鄶?shù)的細(xì)胞培養(yǎng)液都含抗菌素,而溫育時(shí)間又相對(duì)較短。我們選擇帶有的PVDF微孔板是因?yàn)樗鼙葮?biāo)準(zhǔn)ELIS*別的聚丙乙烯(polystyrene)微孔板提供更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
問:我需要用多少細(xì)胞?
答:這個(gè)問題比較難回答,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而異。使用多少細(xì)胞有許多變量:比如細(xì)胞的大小、細(xì)胞的類型、分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞的多少、誘導(dǎo)細(xì)胞的方法等。剛開始時(shí),需要做一些細(xì)胞的稀釋(如,將每孔10,000,000個(gè)細(xì)胞稀釋到100,000甚至到10,000個(gè)細(xì)胞)來決定可形成明顯斑點(diǎn)的*細(xì)胞數(shù)。例如,如果微孔中的細(xì)胞已達(dá)到單層融合狀而大部分細(xì)胞分泌待測的細(xì)胞因子,形成的斑點(diǎn)就很難分開,這樣就很難定量檢測到分泌所測的細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù);在這種情況下,應(yīng)做一系列稀釋(titration),降低細(xì)胞數(shù)。如果在同樣的單層融合狀細(xì)胞中只有少數(shù)細(xì)胞分泌待測的細(xì)胞因子,形成的斑點(diǎn)就會(huì)很明顯,就很容易被定量測定;在第這種情況下,細(xì)胞數(shù)目就是合適的。所以,必須針對(duì)不同細(xì)胞類型和誘導(dǎo)方法來確定每孔中應(yīng)加入細(xì)胞的*數(shù)目。
問:在一個(gè)微孔板上可做多少個(gè)樣本?
答:這是基于96孔微孔板的測試。除去陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、本底(空白)和檢測抗體對(duì)照外,還剩下88孔,可做44個(gè)樣本(每個(gè)樣本做雙份)。
 
 
 
一般常見問題
 
問:蛋白和抗體的期限?
答:R&D Systems有一政策就是不給我們的蛋白和抗體產(chǎn)品提供生產(chǎn)日期或產(chǎn)品期限,從而限制產(chǎn)品的使用期限。在適當(dāng)?shù)膬?chǔ)存條件下,蛋白和抗體趨于穩(wěn)定多年。這些儲(chǔ)存條件包括以干粉形式儲(chǔ)存蛋白、或在蛋白濃度高于0.1毫克/毫升時(shí)冷凍(-20°C或-80°C)儲(chǔ)存蛋白并減少冷凍/解凍的次數(shù)。請參照每一產(chǎn)品插頁中的指示。我們公司常規(guī)的質(zhì)量控制保證每一產(chǎn)品在售出時(shí)都具有生物活性。在實(shí)驗(yàn)者收到產(chǎn)品后,我們無法控制產(chǎn)品的儲(chǔ)存狀況。我們愿以產(chǎn)品保證書來替代產(chǎn)品期限。在正常實(shí)驗(yàn)條件下,我們保證R&D Systems的所有的產(chǎn)品將達(dá)到或超過我們公布的標(biāo)準(zhǔn)。
問:X產(chǎn)品是否可用于X用途但未列入資料單?
答:如果某一特定用途未列入我們的資料單,R&D Systems內(nèi)部沒有更多的數(shù)據(jù)。我們的技術(shù)服務(wù)可以查閱我們的文獻(xiàn)庫,看一看是否有其他實(shí)驗(yàn)人員發(fā)表過這一產(chǎn)品的這類用途、樣本類型、和/或種屬。
問:列在你們上的產(chǎn)品帶有/CF,是什么意思?
答:CF代表無攜帶物。一般來說,每1 mg的細(xì)胞因子都加有50 mg的BSA(攜帶蛋白)以穩(wěn)定細(xì)胞因子。無攜帶物的形式不含任何BSA。通常來說,帶有BSA的細(xì)胞因子比不帶攜帶物的細(xì)胞因子可在更低的濃度保存、有更長的貨架壽命。如果細(xì)胞因子是用于加入細(xì)胞/組織培養(yǎng)或作為ELISA的標(biāo)準(zhǔn),可采用帶有BSA的細(xì)胞分子。當(dāng)細(xì)胞因子是用于原位應(yīng)用、標(biāo)記細(xì)胞因子、或BSA會(huì)產(chǎn)生干擾的實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)采用無攜帶物的細(xì)胞因子。
問:rhEPO是以單位列出的,如何換算成質(zhì)量?
答:R&D Systems的重組人EPO(超純)目錄#286-EP-250,和我們的重組人EPO(組織培養(yǎng)級(jí))目錄#287-TC-500,都有同樣的單位對(duì)質(zhì)量的轉(zhuǎn)換。一單位的rhEPO大約是10 ng。
問:R&D Systems是用什么級(jí)別的BSA來重新配制細(xì)胞因子溶液的?
答:R&D Systems采用Serological Proteins的餾分V BSA(目錄#81-068)來重新配制蛋白溶液。Serological Proteins的是(815)937-8270。
問:為什么一些R&D Systems的重組蛋白有Fc融合?
答:Fc可以穩(wěn)定分子。R&D Systems利用Fc部分有趨于成雙聚體的傾向,創(chuàng)建有生物活性的雙聚體分子。以受體/ Fc嵌合體為例,與其可溶性受體相比,這種融合體輔助我們創(chuàng)建了可與它的配位體產(chǎn)生更高親和力性的受體。R&D Systems提供同樣的Fc部分作為對(duì)照。目錄是:110-HG,人的重組IgG/Fc。
問:R&D Systems的一些產(chǎn)品為什么需用酸性溶劑來重新配制?
答:采用酸性溶劑來重新配制某些細(xì)胞因子是非常關(guān)鍵的。因?yàn)橛行┘?xì)胞因子的等電子點(diǎn)很高,它們有*的疏水性。如不使用這種酸性重配劑, 這些細(xì)胞因子就很難全部溶于溶液中。因?yàn)橥瑯釉?,我們還建議用同樣的酸性重配劑來儲(chǔ)存這些細(xì)胞因子的分裝樣。這些重配劑的pH值通常在4.5-5。 這些已處于溶液狀態(tài)的蛋白分裝樣可用細(xì)胞培養(yǎng)液(或其它合適的緩沖液)進(jìn)一步稀釋到工作濃度。這樣一來,溶劑中少量的酸可被緩沖掉,可安全用于活細(xì)胞。
問:為什么要將某一細(xì)胞因子用PBS/BSA重新配制如果它是從同樣的溶液中干粉化的?
答:在重配劑中額外的BSA可以幫助細(xì)胞因子的回收、同時(shí)也增加穩(wěn)定性。R&D Systems用于干粉化溶液中的PSA的體積是極微的,所以用的PBS/BSA重配劑并不會(huì)得到2X鹽濃度。如果未按照資料單所述方式來重新配制,R&D Systems將不能保證產(chǎn)品的結(jié)果,因?yàn)槲覀兙褪沁@樣來質(zhì)量控制我們產(chǎn)品的。
問:如何將千道爾頓(kDa)轉(zhuǎn)換成克/摩爾?
答:R&D Systems將我們蛋白的分子量以千道爾頓(kDa)列在資料單上。大概換算率是:1道爾頓=1克/摩爾(即一個(gè)8千道爾頓的蛋白相當(dāng)于8,000克/摩爾)。
問:如何將你們的產(chǎn)品換算成單位?
答:對(duì)細(xì)胞因子而言,業(yè)內(nèi)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的單位。為避免混亂,R&D Systems有意識(shí)地將我們的蛋白以質(zhì)量為單位。普遍接受的定義是:一單位等同于某一實(shí)驗(yàn)的ED50值。很顯然,不同條件下的ED50值會(huì)有所不同。如果遵循某一實(shí)驗(yàn)結(jié)果的單位,或以單位來比較不同供應(yīng)商的產(chǎn)品,必須首先確定產(chǎn)品來源的這一單位是如何定義的。當(dāng)*次用一批新產(chǎn)品或新來源時(shí),R&D Systems強(qiáng)烈建議實(shí)驗(yàn)者先用樣本做一系列稀釋,建議以我們ED50范圍的中點(diǎn)作為稀釋的中點(diǎn),上下各增加和減少5, 10, 20,甚至50倍。
問:為了有生物活性,這個(gè)蛋白要求我用一個(gè)交聯(lián)結(jié)合的抗體-- MAB050。這是一個(gè)什么抗體?我一定要這么做嗎?
答:這個(gè)抗體是針對(duì)6x組蛋白疊序的,我們建議使用的帶有交聯(lián)結(jié)合體的蛋白含有6x組蛋白標(biāo)簽。R&D Systems用這個(gè)抗體來交聯(lián)結(jié)合組蛋白標(biāo)簽,使得帶有組蛋白標(biāo)簽的蛋白具有更高的生物活性。R&D Systems質(zhì)控檢驗(yàn)這些經(jīng)過抗體交聯(lián)結(jié)合的蛋白,保證它們的ED50與未經(jīng)交聯(lián)結(jié)合的蛋白的ED50相符。所以,如不采用交聯(lián)結(jié)合抗體,不同批號(hào)之間的蛋白將有非常顯著的不同的ED50
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