1. 蛋白質(zhì)色譜介質(zhì)的創(chuàng)新－新型色譜介質(zhì)的合成
1.1 雙孔與超大孔色譜介質(zhì)
色譜介質(zhì)是蛋白質(zhì)色譜的核心構(gòu)件。目前商業(yè)化蛋白質(zhì)色譜介質(zhì)的孔道尺寸多在100 nm以下，孔道對(duì)蛋白質(zhì)分子的（擴(kuò)散）傳質(zhì)存在嚴(yán)重地阻滯作用，導(dǎo)致色譜柱效、處理能力（動(dòng)態(tài)吸附容量）和分離度的顯著降低。上世紀(jì)80年代后，若干研究相繼報(bào)道了利用孔內(nèi)對(duì)流傳質(zhì)改善色譜介質(zhì)孔內(nèi)傳質(zhì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?；谶@一思路，1990年前后Afeyan等人合成了聚苯乙烯-二乙烯基苯POROS®介質(zhì)[1]。POROS®介質(zhì)同時(shí)具有600－800nm的對(duì)流孔以及連接這些對(duì)流孔、孔徑在50－150nm的擴(kuò)散孔。POROS®介質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)分子通過(guò)對(duì)流傳質(zhì)而迅速到達(dá)色譜配基附近；而連接對(duì)流孔間的擴(kuò)散孔在縮短擴(kuò)散距離（<1 μm）的同時(shí)也提供了較大的比表面積，從而確保了色譜介質(zhì)的高吸附容量。受此啟發(fā)，一系列基于不同材料和合成方法的大孔、超大孔蛋白質(zhì)色譜介質(zhì)相繼問(wèn)世。天津大學(xué)孫彥等人分別以碳酸鈣顆粒和水為致孔劑合成了具備超大孔結(jié)構(gòu)的瓊脂糖、纖維素以及聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯（GMA）-甲基丙烯酸乙二醇酯（EDMA）等色譜介質(zhì)[3]。蛋白質(zhì)分子在超大孔瓊脂糖離子交換色譜介質(zhì)內(nèi)的有效擴(kuò)散系數(shù)為傳統(tǒng)瓊脂糖色譜介質(zhì)的2倍以上，動(dòng)態(tài)吸附容量提高了50%并且在300－1800 cm/h的線(xiàn)性速度范圍內(nèi)柱效基本恒定[4]。
1.2 微濾膜和整體柱
另一種引入微米級(jí)孔道結(jié)構(gòu)的方法是以微濾膜為色譜介質(zhì)。這種以微濾膜為色譜介質(zhì)的色譜分離方法稱(chēng)為膜色譜。微濾膜的孔徑通常在0.22
μm以上，在跨膜壓差作用下料液中的蛋白質(zhì)分子以主體流動(dòng)的方式流經(jīng)微濾膜，接近膜孔表面的色譜配基。因此，膜色譜可以實(shí)現(xiàn)高流速下目標(biāo)蛋白質(zhì)的快速分離。由于微濾膜內(nèi)無(wú)擴(kuò)散孔且膜厚度有限（100-200 μm），膜色譜的處理能力和柱效通常很低，因此更多地應(yīng)用于親和色譜中。
整體柱技術(shù)是解決上述瓶頸的有效方法。整體柱的色譜介質(zhì)是在色譜柱內(nèi)通過(guò)原位聚合方法合成的柱狀多孔固定相，其可看作是若干疊加的微濾膜。與超大孔色譜介質(zhì)粒子類(lèi)似，整體柱內(nèi)同時(shí)具備微米級(jí)的對(duì)流孔和納米級(jí)的擴(kuò)散孔[5]。與膜色譜相比，整體柱內(nèi)擴(kuò)散孔提供了更大的吸附面積，解決了膜色譜處理能力低的問(wèn)題。與填充超大孔粒子的常規(guī)固定床色譜相比，整體柱的制備方法更便捷、重現(xiàn)性更好；整體柱的空隙率幾可忽略不計(jì)（填充床色譜柱通常在0.3-0.5之間），處理能力得以顯著提升；流經(jīng)整體柱的流動(dòng)相均以主體流動(dòng)方式穿過(guò)對(duì)流孔，傳質(zhì)速率更快。
在此基礎(chǔ)上，孫彥等人構(gòu)想了一個(gè)整體柱色譜的理想結(jié)構(gòu)模型，如圖1所示
[3]。整體柱的對(duì)流孔由內(nèi)徑
1－5μm、緊密排布且平行于色譜柱軸向的六角直管構(gòu)成；六角直管管壁的多孔骨架（圖1中灰色部分）則形成整體柱的擴(kuò)散孔，其厚度為1－5μm。色譜過(guò)程中，流動(dòng)相可徑直流經(jīng)色譜柱，有效地降低了流動(dòng)相的流動(dòng)阻力。構(gòu)成擴(kuò)散孔的多孔骨架一方面縮短了蛋白質(zhì)分子孔內(nèi)擴(kuò)散距離，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)分子與吸附位點(diǎn)的快速結(jié)合；另一方面，多孔骨架提供了更大的吸附面積，提高了吸附容量。因此，整體柱在滿(mǎn)足流動(dòng)相高傳質(zhì)速率的同時(shí)，確保了蛋白的高吸附容量。但該方法的實(shí)現(xiàn)還需要在材料、合成工藝方面的進(jìn)一步創(chuàng)新。
圖1 理想色譜介質(zhì)的結(jié)構(gòu)示意圖[3]
1.3 葡聚糖接枝離子交換色譜介質(zhì)
近來(lái)，一種以Sepharose XL系列介質(zhì)為代表的離子交換色譜介質(zhì)引起了廣泛關(guān)注。這類(lèi)介質(zhì)是通過(guò)將葡聚糖接枝于常規(guī)色譜介質(zhì)的孔道表面，進(jìn)而偶聯(lián)離子交換配基的方法得到的。Stone等人的研究表明，接枝分子量為40kDa葡聚糖的Sepharose 6B色譜介質(zhì)的孔徑由19.4 nm降低到6.1 nm；但在葡聚糖接枝的離子交換色譜介質(zhì)內(nèi)，溶菌酶的有效擴(kuò)散系數(shù)卻可達(dá)其在自由溶液中的5-10倍[6]；同時(shí)，蛋白質(zhì)的飽和吸附量也有明顯提高[7]。
蛋白質(zhì)色譜的處理能力不僅取決于傳質(zhì)速率也與介質(zhì)的飽和吸附量有關(guān)。受限于蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度，蛋白質(zhì)在色譜介質(zhì)上的吸附容量往往低于500 mg/mL[8]。在有限的吸附容量條件下，選擇性吸附目標(biāo)蛋白成為今后蛋白質(zhì)色譜發(fā)展的一個(gè)重要方向。這方面的研究工作已經(jīng)有了一些非常有益的嘗試[3]。
2. 蛋白質(zhì)色譜的過(guò)程集成－膨脹床色譜
2.1 膨脹床色譜的方法和優(yōu)勢(shì)
細(xì)胞培養(yǎng)的粗料液中不僅含有目標(biāo)蛋白還包括大量共存的可溶性（如雜蛋白、核酸等）及不可溶性雜質(zhì)（如細(xì)胞碎片等），因此需要引入額外的單元操作來(lái)處理共存的雜質(zhì)。這勢(shì)必導(dǎo)致目標(biāo)蛋白收率的降低。在生物分離過(guò)程中，多個(gè)單元操作的過(guò)程集成是解決這一問(wèn)題的有效途徑之一。
膨脹床色譜就是這樣的一種將細(xì)胞（碎片）分離、蛋白吸附和目標(biāo)蛋白回收等步驟集成的色譜分離技術(shù)。膨脹床色譜柱的頂部和底部分別安裝有可調(diào)節(jié)高度的高度調(diào)節(jié)器和可自由通過(guò)細(xì)胞碎片的流體分布器。色譜柱內(nèi)填充的具有一定粒徑和密度分布的色譜介質(zhì)；當(dāng)流動(dòng)相自柱底高速流入時(shí)，色譜介質(zhì)在流動(dòng)相的作用下流態(tài)化，沿色譜柱軸向形成穩(wěn)定的粒徑和（或）密度分布，床層的空隙率大為提高（可到0.8以上），粗料液中的細(xì)胞或細(xì)胞碎片等固體雜質(zhì)可自由通過(guò)。膨脹床色譜可認(rèn)為是一種穩(wěn)定的流化床模式；與常規(guī)流化床相比，膨脹床色譜中流動(dòng)相以近平推流的方式流經(jīng)色譜柱，固、液兩相返混程度較低，近似于固定床色譜。因此，膨脹床色譜技術(shù)適用于從含有固形雜質(zhì)的粗料液中回收目標(biāo)產(chǎn)物。
2.2 膨脹床色譜介質(zhì)及分級(jí)特性
膨脹床色譜成功的關(guān)鍵在于開(kāi)發(fā)的色譜介質(zhì)。表1列出了若干商品化膨脹床色譜介質(zhì)的特性參數(shù)。為了適應(yīng)膨脹床色譜高流速操作的需要，理想的膨脹床色譜介質(zhì)應(yīng)當(dāng)具有較高的密度和較短的介質(zhì)內(nèi)傳質(zhì)路徑，高密度小粒徑色譜介質(zhì)和薄殼型色譜介質(zhì)成為了膨脹床色譜介質(zhì)的發(fā)展方向。孫彥等人先后開(kāi)發(fā)了多種瓊脂糖包裹高密度惰性材料（如氧化鋯-硅膠、玻璃珠等）的高密度薄殼型膨脹床色譜介質(zhì)[3]。在相同的操作條件下，瓊脂糖包裹玻璃珠的薄殼型色素親和色譜介質(zhì)的動(dòng)態(tài)吸附容量可達(dá)商業(yè)化膨脹床色譜介質(zhì)的2倍以上[9]。
表1 商品化的膨脹床色譜介質(zhì)及主要特性（Spherodex，預(yù)裝柱，瓊脂糖凝膠，美國(guó)GE）
| 名稱(chēng) | 材料 | 粒徑分布 （μm） | 介質(zhì)密度 （g/mL） |
| Streamline 系列介質(zhì) | 瓊脂糖包埋微米級(jí)石英砂顆粒 | 100－300 | ～1.2 |
| Rhobust Fastline介質(zhì) | 瓊脂糖包埋碳化鎢顆粒 | 20－200 | 3.0 （2.5－3.5） |
| Spherodex系列介質(zhì) Spherosil LS系列介質(zhì) AG-S[3] AG-L[3] | 硅膠表面偶聯(lián)葡聚糖 硅膠表面偶聯(lián)硅烷醇 瓊脂糖包裹氧化鋯-硅膠顆粒 小玻璃珠/4%瓊脂糖薄層 大玻璃珠/4%瓊脂糖薄層 | 100－300 ～190 ～136 70－190 130－280 | － 1.34 2.39 1.77 1.98 |
填充于色譜柱中的膨脹床色譜介質(zhì)在流動(dòng)相流速的作用下沿色譜柱軸向方向形成穩(wěn)定的粒徑和密度分布。這種分布取決于由Stokes沉降速率方程確定的色譜介質(zhì)的終端速度，其中終端速度大的色譜介質(zhì)主要分布于色譜柱底部，終端速度小的色譜介質(zhì)分布于色譜柱頂部。孫彥等人研究結(jié)果表明，6%瓊脂糖包埋石英砂顆粒的Streamline介質(zhì)在膨脹床色譜軸向存在著明顯的粒徑分布（80－500 μm）而無(wú)密度分布；由此相反，6%瓊脂糖包裹不銹鋼微球的6AS介質(zhì)則沿色譜柱軸向呈現(xiàn)顯著的密度分布[10]。色譜介質(zhì)沿膨脹床色譜軸向的這種粒徑或密度分布可與柱內(nèi)采樣高度（h）很好地關(guān)聯(lián)。周鑫等人對(duì)瓊脂糖包裹不同粒徑玻璃珠的薄殼型色譜介質(zhì)的分級(jí)規(guī)律研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，膨脹床色譜內(nèi)介質(zhì)的軸向密度分布隨著介質(zhì)密度的增大而越加顯著；當(dāng)介質(zhì)密度很大時(shí)，介質(zhì)沿軸向呈現(xiàn)明顯的密度分布，粒徑分布則可忽略[11]。周鑫等人提出了如下的經(jīng)驗(yàn)方程關(guān)聯(lián)介質(zhì)在膨脹床內(nèi)的粒徑和密度分布[11]，
（1）
其中，S為，
（2）
在膨脹床色譜過(guò)程中，固相介質(zhì)的分級(jí)特性還受到溶液組成、性質(zhì)等因素的影響。楊征和孫彥發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流動(dòng)相的粘度由低變高時(shí)，膨脹床色譜柱底的空隙率持續(xù)增大；而色譜柱中部和上部的空隙率則由于底部介質(zhì)向上的擠壓作用而呈現(xiàn)先降后升的規(guī)律
[12]。
Fenandez-Lahore等人發(fā)現(xiàn)，處理含有細(xì)胞的粗料液過(guò)程中，膨脹床的空隙率必須超過(guò)80%以確保操作的穩(wěn)定性
[13]。
2.3 膨脹床色譜的應(yīng)用
膨脹床色譜已成功地應(yīng)用于不同蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程。Clemmitt和Chase利用Streamline Chelating介質(zhì)從大腸桿菌細(xì)胞勻漿液中直接提取了含有組氨酸標(biāo)簽的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，收率達(dá)到80%以上 [14]。同時(shí)，膨脹床色譜也受到了產(chǎn)業(yè)界的關(guān)注。DSM生物技術(shù)公司的Doeven和Boer利用裝填MabDirect Protein A的膨脹床色譜柱直接從CHO細(xì)胞培養(yǎng)液（50L）中捕集單抗，單抗的收率和純度均不低于現(xiàn)有工藝[15]。
3. 蛋白質(zhì)色譜的過(guò)程強(qiáng)化－電色譜技術(shù)
電色譜是一種在外加電場(chǎng)作用下的液相色譜分離技術(shù)。在電色譜過(guò)程中，流動(dòng)相在電滲流、壓力流的推動(dòng)下流經(jīng)色譜柱，其間荷電溶質(zhì)的傳質(zhì)源自主體流動(dòng)、電泳和電滲流等的共同作用。上世紀(jì)五、六十年代，研究人員開(kāi)始嘗試將電場(chǎng)引入到色譜分離過(guò)程中并報(bào)道了分離血清蛋白的成功案例[16]。在電色譜過(guò)程中，液相主體流動(dòng)的推動(dòng)力來(lái)自壓力和電滲作用；溶質(zhì)在色譜介質(zhì)內(nèi)的輸送則通過(guò)擴(kuò)散傳質(zhì)和電動(dòng)傳質(zhì)完成?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)和理論分析結(jié)果顯示，外加電場(chǎng)可誘導(dǎo)色譜介質(zhì)內(nèi)液相發(fā)生主體流動(dòng)。這與此前介紹的蛋白質(zhì)在對(duì)流孔內(nèi)的傳質(zhì)行為異曲同工，可顯著提高蛋白質(zhì)在孔內(nèi)傳質(zhì)速率，進(jìn)而提高色譜柱的柱效。另一方面，由于色譜介質(zhì)孔道對(duì)傳質(zhì)的阻滯作用和對(duì)蛋白分子的空間排阻作用，蛋白質(zhì)在介質(zhì)內(nèi)的傳質(zhì)速率通常要明顯小于其在主體液相中的傳質(zhì)速率，由此導(dǎo)致蛋白分子在色譜介質(zhì)表面的“累積”，形成濃差極化（concentration polarization）現(xiàn)象。濃差極化現(xiàn)象為電色譜過(guò)程中的蛋白質(zhì)分子提供了一個(gè)新的保留機(jī)理。
色譜過(guò)程中的電場(chǎng)主要是通過(guò)軸向電場(chǎng)和橫向交變電場(chǎng)兩種方式引入的。目前報(bào)道的多數(shù)制備型電色譜是通過(guò)外加軸向電場(chǎng)的方式實(shí)現(xiàn)的，其中電場(chǎng)強(qiáng)度方向與流動(dòng)相的流動(dòng)方向平行。在軸向電場(chǎng)作用下的電色譜中，外加電壓與色譜柱高成正比，因此色譜放大過(guò)程中色譜柱高的加長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致外加電壓的升高和操作成本的增加。另外，高電壓的應(yīng)用也會(huì)產(chǎn)生大量的焦耳熱和電解氣，由此帶來(lái)色譜柱散熱困難和電解氣的“累積”，影響到電色譜操作的穩(wěn)定性。為了解決上述問(wèn)題，孫彥等人提出了橫向交變電場(chǎng)的電色譜技術(shù) [17]，即色譜過(guò)程中電場(chǎng)強(qiáng)度的方向垂直于流動(dòng)相的流動(dòng)方向。帶有橫向交變電場(chǎng)的電色譜柱由位于中間的凝膠室及其兩側(cè)的電解液室構(gòu)成，凝膠室與電解室之間采用裝填25%聚丙烯酰胺凝膠的多孔陶瓷板隔開(kāi)。這種新型電色譜柱設(shè)計(jì)縮短了電極的距離，從而確保了用較低電壓獲得所需的電場(chǎng)強(qiáng)度。孫彥等人將此電色譜成功地應(yīng)用于凝膠過(guò)濾色譜、離子交換色譜和親和色譜分離蛋白質(zhì)的過(guò)程中。賈國(guó)棟等人對(duì)比了不同的電場(chǎng)引入方式對(duì)電色譜性能的影響[18]。結(jié)果如表2所示。從中可以看出，在外電場(chǎng)的作用下，色譜的處理能力（用δ50表示）要明顯高于無(wú)外加電場(chǎng)的常規(guī)色譜。
表2 不同外電場(chǎng)模式下色譜處理能力（δ50值）的比較
| 電場(chǎng) | 橫向交變電場(chǎng) | 軸向電場(chǎng) | 二維電場(chǎng) |
| 60mA | 100mA | 10mA | 20mA |
| δ50 | 2.4 | 3.8 | 2.4 | NA* | 4.5 |
4. 展望
作為生物下游的核心技術(shù)之一，蛋白質(zhì)色譜技術(shù)一直受到學(xué)界和產(chǎn)業(yè)界的廣泛關(guān)注并取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。在今后相當(dāng)長(zhǎng)的階段，蛋白質(zhì)色譜技術(shù)的創(chuàng)新、過(guò)程的優(yōu)化和理論的*仍將是蛋白質(zhì)色譜發(fā)展的主要方向。同時(shí)，蛋白質(zhì)分子界面現(xiàn)象的準(zhǔn)確描述和蛋白質(zhì)吸附機(jī)理的正確闡述也將為蛋白質(zhì)色譜技術(shù)的化提供科學(xué)的指導(dǎo)。因此，可以預(yù)見(jiàn)未來(lái)蛋白質(zhì)色譜技術(shù)的研究將是由多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和研究手段支撐的、在多個(gè)尺度上共同開(kāi)展并相互關(guān)聯(lián)的理論和實(shí)踐工作。這將為生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供強(qiáng)有力的支撐。
符號(hào)說(shuō)明
a 方程（1）中的常數(shù)，無(wú)因次；
b 方程（1）中的常數(shù)，無(wú)因次；
D 采樣高度處的平均粒徑，μm；
D0 色譜介質(zhì)的平均粒徑，μm；
h 柱內(nèi)采樣高度，m；
H 膨脹狀態(tài)下床層的高度，m；
S 方程（2）確定的參數(shù)，無(wú)因次；
ρ 采樣高度處介質(zhì)的平均密度，g/mL；
ρ0 色譜介質(zhì)的平均密度，g/mL；
ρL 流動(dòng)相溶液的密度，g/mL；
δ50 電場(chǎng)作用下色譜的動(dòng)態(tài)吸附容量與常規(guī)色譜的動(dòng)態(tài)吸附容量之比，無(wú)因次
更新時(shí)間：2012-04-10 
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